mRNA疫苗和藥物共轉(zhuǎn)錄加帽技術(shù)研究進(jìn)展

應(yīng)同寫意邀請，公司董事長張健存博士在“2022新型生物藥先進(jìn)技術(shù)峰會”上做了《mRNA疫苗和藥物共轉(zhuǎn)錄加帽技術(shù)研究進(jìn)展》的報告，本文系根據(jù)報告內(nèi)容整理。

? ? ? ?眾所周知，分子生物學(xué)的核心理論，是從DNA到RNA、蛋白。而轉(zhuǎn)錄，就是從DNA生成RNA的過程。

? ? ? ?但是，在細(xì)胞核內(nèi)以DNA模板生成的是premature的RNA，需要在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行一系列后轉(zhuǎn)錄的修飾，生成成熟的mRNA，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行后續(xù)的翻譯過程，形成相應(yīng)的蛋白。

? ? ? ?后轉(zhuǎn)錄修飾是非常復(fù)雜的過程，包括幾種酶的應(yīng)用。下圖大體描述了這一過程的變化。

? ? ? ?mRNA疫苗和藥物因?yàn)榫邆浒踩愿?、免疫性好、開發(fā)周期短以及量產(chǎn)迅速等優(yōu)勢，已經(jīng)逐步應(yīng)用到傳染病疫苗、腫瘤細(xì)胞治療、罕見病治療、蛋白代替療法等領(lǐng)域。

1、mRNA的結(jié)構(gòu)

? ? ? ?在真核細(xì)胞中，成熟的mRNA具備一些關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)元件來發(fā)揮相關(guān)的功能。而體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，則是通過模擬內(nèi)源性mRNA的結(jié)構(gòu)來發(fā)揮作用。

? ? ? ?成熟mRNA的結(jié)構(gòu)主要有五個部分，從5' 到3' 包括：5' 帽子結(jié)構(gòu)（5' cap）、5' 非翻譯區(qū)（5' UTR）、編碼抗原的開放閱讀框、3' 非翻譯區(qū)（3' UTR）和一個PolyA尾。

? ? ? ?新冠mRNA疫苗快速研發(fā)、生產(chǎn)和批準(zhǔn)，使世界對mRNA有了更深入的認(rèn)識。當(dāng)前有很多研究正在開展，不僅是疫苗、藥物應(yīng)用上，也涉及各種細(xì)胞治療、基因治療方面，驗(yàn)證著mRNA的潛力。

? ? ? ?而想要實(shí)現(xiàn)這些突破，帽子結(jié)構(gòu)（cap）對于mRNA來說至關(guān)重要。

? ? ? ?5' 帽子結(jié)構(gòu)包含一個7-甲基鳥苷核苷。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，5' 端帽子結(jié)構(gòu)可以調(diào)節(jié)mRNA的剪切成熟，并幫助RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物穿過核膜的選擇性孔道而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。

? ? ? ?此外，5' 帽子結(jié)構(gòu)還可以保護(hù)mRNA不被核酸外切酶降解，與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，招募核糖體，并協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合，使翻譯從AUG開始。

? ? ? ?抗原編碼區(qū)兩側(cè)的5' UTR、3' UTR和PolyA尾的長度，則可以調(diào)節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

? ? ? ?mRNA疫苗和藥物的開放閱讀框，是實(shí)現(xiàn)功能的關(guān)鍵組成部分。這部分通過密碼子優(yōu)化，在不改變蛋白質(zhì)序列的情況下增加翻譯。在轉(zhuǎn)錄過程中，該部分加入假尿苷、N1-甲基假尿苷或其他核苷類似物，這些修飾核苷酸的引入阻止了模式識別受體的識別，確保翻譯過程產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)。

? ? ? ?分別來自Moderna和Pfizer/BioNTech的兩款新冠mRNA疫苗，都含有前述的核苷修飾。

2、真核生物mRNA帽子結(jié)構(gòu)

? ? ? ?帽子結(jié)構(gòu)是指在真核生物中轉(zhuǎn)錄后修飾形成的成熟mRNA在5'端的一個特殊結(jié)構(gòu)，即m7GPPPN結(jié)構(gòu)，又稱為甲基鳥苷帽子。它是在RNA三磷酸酶、mRNA鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶、mRNA（鳥嘌呤-7）甲基轉(zhuǎn)移酶和mRNA（核苷-2' ）甲基轉(zhuǎn)移酶催化形成的。

? ? ? ?根據(jù)甲基化程度不同，在自然界的mRNA可形成3種類型的帽子：Cap 0、Cap 1和Cap 2。

? ? ? ?鳥苷以5'-5' 焦磷酸鍵與初級轉(zhuǎn)錄本的5' 端相連。當(dāng)G第7位碳原子被甲基化形成m7GPPPN時，此時的帽子稱為“Cap 0”，它存在于單細(xì)胞中。

? ? ? ?如果轉(zhuǎn)錄本的第一個核苷酸的2'-O位也甲基化，形成m7GPPPNm，稱為“Cap 1”，除了單細(xì)胞生物外，這是一種多數(shù)的帽子形式。

? ? ? ?換言之，Cap 0和Cap 1的主要區(qū)別，在于第一個核苷酸的2'-O位羥基是否被甲基化。甲基化具有非常重要的活性和功能，可以提高mRNA在體內(nèi)表達(dá)量，同時幫助mRNA逃脫體內(nèi)免疫系統(tǒng)識別，更好地穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)。

? ? ? ?如果轉(zhuǎn)錄本的第一、二個核苷酸的2'-O位均甲基化，成為m7G-PPPNmNm，則稱為“Cap2”。10%-15%真核細(xì)胞中存在Cap 2，但它的作?在很?程度上尚未得到探索。

? ? ? ?真核生物帽子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度與生物進(jìn)化程度關(guān)系密切。而mRNA想要成為一種大規(guī)模的商業(yè)化產(chǎn)品，體外轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)尤其關(guān)鍵。

? ? ? ?mRNA疫苗或者藥物需要形成Cap 1結(jié)構(gòu)，才能在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

3、mRNA加帽的方法

? ? ? ?在體外轉(zhuǎn)錄、制備mRNA有不同的方法，包括酶加帽、共轉(zhuǎn)錄加帽等。

①、酶加帽

? ? ? ?這種方法最為傳統(tǒng)，通過dsDNA作為底物，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄形成RNA，再經(jīng)后續(xù)修飾成為mature的RNA。

? ? ? ?這方面有一個發(fā)現(xiàn)值得關(guān)注。利用牛痘病毒加帽酶（VCE, Vaccinia caping enzyme）和二氧甲基轉(zhuǎn)移酶（2'O-methyltransferase），可以實(shí)現(xiàn)天然未修飾的帽結(jié)構(gòu)。

? ? ? ?這種方法幾乎可以達(dá)到100%的加帽率，問題在于，牛痘病毒加帽酶比較昂貴，需要的酶促成本高（T7聚合酶、無機(jī)焦磷酸酶、DNA酶I），批量生產(chǎn)成本高。另外，引入了額外的蛋白和S-腺苷甲硫氨酸（SAM），工藝流程繁瑣，需多次純化，增加了QA/QC檢測項(xiàng)。

②、共轉(zhuǎn)錄加帽

? ? ? ?利用帽類似物直接進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄生成帶帽結(jié)構(gòu)的mRNA，工藝流程簡便，迅速提升mRNA疫苗和藥物的產(chǎn)能。

? ? ? ?基于化學(xué)合成工藝的發(fā)展，帽類似物的結(jié)構(gòu)已經(jīng)從最開始第一代的mCap逐步發(fā)展到第二代的ARCA和第三代Cap 1類似物（CleanCap）。

? ? ? ?第一代帽類似物mCap，標(biāo)準(zhǔn)帽結(jié)構(gòu)類似物由于存在兩個游離的3'-OH部分，m7Gppp G能夠以兩種方向整合m7G（5' ）pppG-RNA或G（5‘）pppm7G-RNA，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本為5' -加帽和5' -三磷酸的混合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

? ? ? ?帽類似物以錯誤的方向摻入形成的反向帽結(jié)構(gòu)與eIF4E結(jié)合很差，mRNA則無法有效翻譯，從而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白產(chǎn)量低。

? ? ? ?ARCA（抗反向帽類似物）是第二代帽類似物。因?yàn)锳RCA在第三位進(jìn)行了甲氧基的修飾，只有一個3'-OH基團(tuán)，進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄時為定向整合，因此轉(zhuǎn)錄過程中只能以正確的方向插入，所形成的mRNA被翻譯時的效率相當(dāng)于mCap形成的mRNA的兩倍。

? ? ? ?在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，使用ARCA與GTP的4:1混合物將得到約70%的加帽mRNA。ARCA共轉(zhuǎn)錄生成Cap 0結(jié)構(gòu)的mRNA，1μg起始模板量大約轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生~30μg mRNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低，并且需要二氧甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步作用生成Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA。

? ? ? ?第三代Cap1類似物（CleanCap）共轉(zhuǎn)錄直接生成Cap1結(jié)構(gòu)的mRNA，1μg起始模板量大約轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生80-100μg mRNA產(chǎn)量高，加帽效率提高到90%以上。

? ? ? ?第三代方法解決了ARCA產(chǎn)量低和加帽效率低的問題。BioNTech上市的新冠疫苗BNT162b2采用共轉(zhuǎn)錄加帽工藝。

? ? ? ?不過，由于這種技術(shù)涉及高昂的專利費(fèi)，業(yè)界也亟需能夠避開專利實(shí)現(xiàn)共轉(zhuǎn)錄加帽的新方法。需要考量的因素包括：高效轉(zhuǎn)錄過程具有較高的mRNA加帽率；能被eIF4E復(fù)合體識別，轉(zhuǎn)錄率高；mRNA穩(wěn)定性好；易于擴(kuò)大規(guī)模和成本效益等。

? ? ? ?迄今為止，也有很多的研究聚焦在帽結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾上，通過在帽結(jié)構(gòu)的不同位置進(jìn)行不同的修飾改造，可以增加mRNA的表達(dá)量。

4、恒諾康核苷核酸平臺

? ? ? ?恒諾康致力于同各國創(chuàng)新，提供高質(zhì)量、高性能且具有價格優(yōu)勢的系列核苷核酸原料，積累了30多年的核苷核酸化學(xué)經(jīng)驗(yàn)和積累，包括修飾核苷合成、核苷三磷酸產(chǎn)業(yè)化工藝、核苷phosphoramidites等。

? ? ? ?更重要的是，恒諾康推出系列mRNA疫苗和藥物原料，涉及NTPs, PseudoUTP, N1-Me-pseudoU TP, Modified NTPs，以及專利產(chǎn)品ARCA, trinucleotide LZ Caps。

? ? ? ?在產(chǎn)能方面，目前恒諾康建立了2200㎡專業(yè)GMP-like設(shè)施、生產(chǎn)體系和分析質(zhì)量體系，可以確保多公斤級Batch產(chǎn)能。

? ? ? ?其中一個產(chǎn)品是對標(biāo)ARCA的dinucleotide cap，表達(dá)量比前者更有優(yōu)勢。

? ? ? ?三核苷加帽原料方面，恒諾康的trinucleotide cap LZ Cap對標(biāo)CleanCap，可以滿足“一鍋法”mRNA制備，比Clean Cap有更高的mRNA產(chǎn)率和蛋白表達(dá)量。

? ? ? ?核苷酸原料在mRNA疫苗的原材料成本中占比高達(dá)40%以上，是mRNA疫苗和藥物的核心元件，特別是滿足“一鍋法”的三核苷的加帽試劑，例如Clean Cap由于有專利保護(hù)，成為制約這一領(lǐng)域發(fā)展的“卡脖子”技術(shù)。

? ? ? ?恒諾康希望通過提供高效、高質(zhì)量的系列核苷關(guān)鍵原料，幫助國內(nèi)外mRNA疫苗和藥物企業(yè)快速推動產(chǎn)品研發(fā)。